Einleitung – Epidemiologie von Substanzdefekten des knöchernen Bewegungsapparates

Mehr als die Hälfte aller chronischen Erkrankungen bei Patienten über 60 Jahre sind heute bereits Gelenkerkrankungen. Jeder vierte Mensch in diesem Alter leidet dadurch unter starken Schmerzen und ist in seiner Beweglichkeit erheblich eingeschränkt. Allein in Deutschland haben schätzungsweise 15 Millionen Menschen zumindest zeitweise Gelenkbeschwerden.¹ Die Zahl der jährlich implantierten Hüftendoprothesen in Deutschland liegt bei etwa 150.000 und für Knieendoprothesen bei etwa 60.000. Die stetige Zunahme der Älteren in der Gesellschaft macht eine weitere deutliche Steigerung der Operationszahlen wahrscheinlich.² In der Wirbelsäulenchirurgie, in der Tumororthopädie und insbesondere für endoprothetische Revisionseingriffe, die häufig mit großen knöchernen Substanzdefekten einhergehen, besteht ein hoher Bedarf an Knochentransplantaten und/oder Knochenersatzmaterialien.

Auch osteoporosebedingte Frakturen haben in den letzten Jahren stark zugenommen. Untersuchungen zeigen, dass zehn Prozent aller Männer und Frauen eine oder mehrere osteoporosebedingte Wirbelkörperveränderungen haben.³ Jährlich tritt bei etwa fünf Prozent aller 50- bis 79-jährigen Frauen eine neue osteoporosebedingte Wirbelkörperdeformität auf.

Durch die Weiterentwicklung interdisziplinärer Therapiemöglichkeiten konnte die Anzahl der Extremitäten erhaltenden Eingriffe bei Patienten mit primären oder sekundären Knochentumoren deutlich gesteigert werden. Für die wachsende Zahl der aus tumorchirurgischen Eingriffen resultierenden ossären Substanzdefekte stehen jedoch nur begrenzte und häufig unbefriedigende Therapieoptionen zur Verfügung.

Auch in der Traumatologie sind größere Knochendefekte von epidemiologischer Bedeutung. So wird die Häufigkeit der Schenkelhalsfrakturen für Deutschland auf über 100.000 pro Jahr geschätzt. Das Risiko, einen solchen Bruch zu erleiden, nimmt mit dem Alter exponentiell zu und verdoppelt sich jenseits des 65. Lebensjahres mit jedem Lebensjahrzehnt.

Die Erkrankungen und Verletzungen der Haltungs- und Bewegungsorgane stehen aber nicht nur bei Patienten im fortgeschrittenen Alter im Vordergrund. Mehr als 40 Prozent der jungen Erwachsenen haben ihren ersten Arztkontakt aufgrund von Erkrankungen oder Verletzungen des Stütz- und Bewegungsapparates.

Trotz der offensichtlichen volkwirtschaftlichen und gesellschaftlichen Bedeutung dieser Erkrankungen und Verletzungen fand weltweit bisher keine adäquate Reflexion mit dem Ziel statt, die Forschungsförderung und die Ausbildung der Medizinstudierenden dieser Entwicklung anzupassen. In einer Untersuchung in den USA fand sich unter den 29 am höchsten geförderten Forschungsbereichen der National Institutes of Health (NIH) kein einziger aus dem Bereich der chronischen Erkrankungen der Bewegungsorgane. In Deutschland zeigt sich ein vergleichbares Bild: 1998 förderte die Deutsche Forschungsgemeinschaft 34 "klinische Forschergruppen"; lediglich eine beschäftigte sich mit dem Bewegungsapparat.

Therapeutische Möglichkeiten in der Behandlung von Knochendefekten

Derzeit stehen mehrere Behandlungsmöglichkeiten zur Therapie von Knochendefekten zur Verfügung. Zu den operativen Verfahren gehören die Osteosynthesen, die Transplantation von Spender- sowie autologem Knochen, die Eröffnung von benachbarten Knochenarealen zur lokalen Durchblutungsverbesserung und das Einbringen von Ersatzstoffen (Biomaterialien). Während die autologe Spongiosatransplantation einen patientenbelastenden Sekundäreingriff mit einer bis zu 40-prozentigen Komorbidität (Infektion, Hämatom, Verletzung subkutaner Nerven mit Hyp- und Dysaesthesien) impliziert,⁴ sind die derzeit im klinischen Einsatz befindlichen Biomaterialien durch eine unzureichende biologische Aktivität und/oder biomechanische Langzeitstabilität gekennzeichnet. Demgegenüber zielen nichtoperative Behandlungskonzepte überwiegend auf eine symptomatische Therapie.

Überschreiten die knöchernen Substanzdefekte jedoch eine kritische Größe (Critical Size Defect, CSD), die für lange Röhrenknochen bei ca. fünf bis zehn Prozent ihrer longitudinalen Länge liegt, so führen auch die angeführten Behandlungskonzepte in der Regel zu bleibenden Schäden und Funktionsverlusten und damit nicht zum gewünschten Erfolg. Die Gründe hierfür liegen insbesondere in den limitierten Ressourcen von geeigneten Knochenersatzmaterialien und deren geringer biologischer Aktivität bei steigendem Bedarf.

In den 1970er und 80er Jahren wurden mesenchymale Progenitorzellen aus dem Knochenmark isoliert, die unter geeigneten In-vitro-Kulturbedingungen osteoblastär differenzierten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass diese Zellpopulation eine Multipotenz besitzt, wodurch unter geeigneten Kulturbedingungen die Differenzierung in andere mesenchymale Zellreihen möglich ist (Abb. 1). Während der 1990er Jahre wurden diese Techniken weiterentwickelt und standardisiert, so dass eine erste klinische Anwendung von mesenchymalen Stammzellen für Knochendefekte, die über eine Spongiosatransplantation hinausgeht, zukünftig eine mögliche Therapieoption darstellt. Seit wenigen Jahren gelingt auch die Isolation von mesenchymalen Progenitorzellen aus dem Nabelschnurblut. Da diese Zellpopulation ein hohes In-vitro-Regenerationspotential zeigte, besteht Hoffnung für einen zukünftigen therapeutischen Einsatz am Bewegungsapparat.⁵

Die mesenchymale Stammzelle: Adulte (Knochenmark) versus frühkindliche (Nabelschnurblut) versus embryonale (Somitenmesoderm) Stammzelle

Für eine zukünftige Stammzelltherapie werden derzeit insbesondere drei verschiedene Ursprungsgewebe und die davon abgeleiteten Zellpopulationen diskutiert:

1. Mesenchymale Stammzellen aus dem adulten Knochenmark werden in der Literatur als so genannte mesenchymal stem cell (MSC) beschrieben: Die Hypothese von nicht hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark wurde bereits 1897 von dem deutschen Pathologen Cohnheim aufgestellt.⁶ Die ersten Vorarbeiten zur Isolierung humaner mesenchymaler Stammzellen (hMCS) gehen auf Friedenstein in den 70er Jahren des letzten Jahrhunderts zurück.⁷ In den 80er Jahren kamen zahlreiche Arbeitsgruppen, z. B. von Owen⁸, Cheng⁹, Caplan¹⁰ und Rickard¹¹, hinzu. Die Gemeinsamkeit der genannten Arbeitsgruppen liegt in der Hypothese der Existenz von multipotenten hMSC, die sich in Osteoblasten, Chondroblasten, Myoblasten und Adipoblasten differenzieren können.
2. Aufgrund des hohen Regenerationspotentials wurde für die frühkindliche Stammzelle aus Nabelschnurblut die Bezeichnung "unrestringierte somatische Stammzelle" (unrestringated somatic stem cell, USSC) gewählt: Im Gegensatz zu osteoblastären Progenitorzellen aus dem Knochenmark fanden sich erst Anfang dieses Jahrhunderts erste Hinweise auf ein osteoblastäres Regenerationspotential aus Nabelschnurblutzellen.¹² Diese Zellpopulation scheint insbesondere aufgrund ihres niedrigen Differenzierungsgrades vielversprechend für eine zukünftige therapeutische allogene Zelltransplantation.
3. Embryonale mesenchymale Stammzellen (ESC) sind für eine humane Anwendung ethisch umstritten:¹³ Bezüglich der Herkunft von humanen mesenchymalen Progenitorzellen innerhalb der embryonalen Entwicklung wird davon ausgegangen, dass diese aus dem Somitenmesoderm des Achsenskelettes sowie dem lateralen Mesoderm des Extremitätenskelettes stammen¹⁴ und nach zellulärer Aggregation chondrogenetisch und osteogenetisch differenzieren. Hierbei spielen neben den direkten zellulären Interaktionen zahlreiche lokale Faktoren eine wichtige Rolle. Zu diesen gehören die Transforming Growth Factor (TGF)-Familie, Bone Morphogenic Protein (BMP)-2 und -4 sowie Sonic Hedgehog (SHH), Fibroblastic Growth Factor (FGF)-2 und Wnt-7a.¹⁵

Die zellbiologische Arbeitsgruppe der Orthopädischen Klinik des Universitätsklinikums Düsseldorf (UKD) untersucht wissenschaftliche Fragestellungen zur Zelldifferenzierung, zur Entwicklung von Stammzellregeneraten für Knochendefekte und zur Biokompatibilitätstestung orthopädischer Implantate. Hierbei werden sowohl MSC als auch USSC Zellkultursysteme eingesetzt. Durch Modifizierung der Kulturbedingungen ist es gelungen, aus den genannten Ausgangszellpopulationen eine In-vitro- Differenzierung in osteoblastäre, chondrozytäre und adipozytäre Zellen zu induzieren (Abb. 2). Während die Regeneration von Knorpelgewebe derzeit noch mit zahlreichen Problemen behaftet ist (dreidimensionales Wachstum, Stabilität in der Kollagenexpression), konnte eine dreidimensionale In-vitro-Kalzifizierung im Rahmen der osteoblastären Differenzierung für beide Progenitorzelltypen (MSC, USSC) gezeigt werden. Als charakteristische Marker für den differenzierten Osteoblasten werden die Oberflächenproteine Osteocalcin (OC), Osteopontin (PO), Osteonektin (ON) sowie Kollagen Typ I und Alkalische Phosphatase nachgewiesen. Demgegenüber wurde ein fehlender Nachweis dieser Marker bei gleichzeitiger Negativität gegenüber CD34, einer Positivität für CD13 und CD105 und morphologisch fibroblastoidem Aussehen (Monolayerkultur) als Kriterium für die Definition als mesenchymale Progentorzelle herangezogen.

Tissue Engineering bei Knochendefekten

Die Bedeutung von Stammzellen aus dem Knochenmark als In-vitro- Screeningverfahren für die Biokompatibilitätstestung orthopädischer Implantate konnte in der Vergangenheit in verschiedenen Studien gezeigt werden.¹⁶

Um einen lokotypischen, ossären Gewebeersatz aus Stammzellen im Sinne eines therapeutischen tissue engineering zu erzielen, ist der verwendete Zellcarrier (Biomatrix) von entscheidender Bedeutung, da dieser sowohl die Vitalität und Differenzierung als auch die zytoarchitektonische Ausrichtung des Regenerates mitbestimmt. Die wichtigsten Werkstoffparameter, die die genannten Prozesse beeinflussen, sind:

• die chemiko-physikalischen Oberflächeneigenschaften (Porosität, Oberflächenspannung, Hydrophilie, etc.),
• das In-vitro-/In-situ-Resorptionsverhalten sowie
• die biomechanischen Qualitäten des Werkstoffs.

Für Osteoblastenregenerate werden derzeit insbesondere resorbierbare Werkstoffe, wie z. B. Kollagene oder Keramiken, als Trägermatrices eingesetzt. Unsere Arbeitsgruppe untersucht derzeit die Wirkungen verschiedener polymerer (Polylaktide, Polytetrafluorethylen, Kollagene... ) metallischer (CroCoMb, Titan und Titanlegierungen) und keramischer Carrier (Tricalciumphosphat (TCP), Hydroxylapatit... ) anhand von humanen MSC- und USSC-Zellkulturen und arbeitet an der Optimierung deren Oberflächenstruktur, um die zelluläre Adhärenz zu steigern. Erste positive Erfahrungen wurden bereits mit einem porcinen Kollagen I/III- Trägermaterial gemacht, das sowohl ein dreidimensionales Zellwachstum und eine osteoblastäre Differenzierung zulässt als auch eine In-vitro-Kalzifizierung ermöglicht (Abb. 3).

Einfluss von In-vitro-Kulturbedingungen auf das Wachstum mesenchymaler Stammzellen aus dem Nabelschnurblut und Knochenmark

Da die lokalen Kulturbedingungen wie pH-Wert, O₂/CO₂-Partialdruck, Temperatur und Kulturmediumbestandteile wesentlich zelluläre Wachstums- und Differenzierungsprozesse beeinflussen, führte unsere Arbeitsgruppe eine vergleichende Studie zum Verhalten von MSC und USSC unter Zugabe verschiedener kommerzieller Zellkulturnährmedien durch. Hierbei konnten signifikante Unterschiede in Bezug auf die Förderung einer osteoblastären Differenzierung in Abhängigkeit des verwendeten Zellkultursystems aufgezeigt werden. Nach unseren Ergebnissen eignet sich für die Kultivierung von MSC insbesondere MesenCult , während für USSC das pyruvathaltige low-glucose DMEM Medium signifikante Vorteile bei der Differenzierung von osteoblastären Zellen zeigte.¹⁷ Des Weiteren ist auch die lokale Zelldichte von entscheidender Bedeutung für die Vitalität und osteoblastäre Differenzierungspotenz eines Zellkultursystems für mesenchymale Progenitorzellen. Unsere Arbeitsgruppe konnte für das USSC-Zellsystem niedrigere Toleranzwerte im Vergleich zu MSC aufzeigen (Abb. 4).

Etablierung eines Kleintierversuchsmodells: Der kritische Knochendefekt (CSD) am Rattenfemur

Bisher findet sich in der Literatur kein Hinweis auf ein Kleintiermodell, das sich für Untersuchungen von xenotransplantierten mesenchymalen Stammzellen eignen würde. Daher wurde mit dessen Entwicklung begonnen, nachdem die In-vitro- Kultivierungsbedingungen von MSC und USSC weitgehend standardisiert und definiert waren. Primäres Ziel war hierbei, Möglichkeiten für die Untersuchung von Effekten einer Xenotransplantation von humanen Progenitorzellen aus dem Knochenmark und Nabelschnurblut in Bezug auf Immunogenitäts- und Differenzierungsvorgänge zu erarbeiten. In einem Vorversuch wurde zunächst eine vergleichende radiomorphometrische Analyse von Rattenfemora zweier Spezies durchgeführt (Sprague Dawley versus Wistar-Ratte). Hierbei zeigten sich Vorteile für das Modell Wistar-Ratte. Anschließend wurde eigens ein Mini-Fixateur externe zur Überbrückung eines kritischen Knochendefektes (CSD) von > 3,5 mm entwickelt und dieser zur Stabilisierung des Rattenfemurs eingesetzt. Präoperativ wurden humane Progenitorzellen aus dem Knochenmark und Nabelschnurblut zunächst auf einem Kollagen I/III-Träger kultiviert, bis eine ausreichende zelluläre Adhärenz gewährleistet war (Adhärenzermittlung anhand von Standardkurven in Abhängigkeit von der Zellzahl). Anschließend wurde das Zell-Biomaterial-Komposit in den CSD der Wistar- Ratte implantiert und fixiert. Erste Hinweise für ein Überleben einzelner USSC fand die orthopädische Arbeitsgruppe 14 Tage nach der Xenotransplantation. Die humanen Zellen waren zuvor mit dem fluoreszierenden pkh26-Antikörper markiert worden. Weitere Experimente an athymen rhnu-Ratten werden derzeit durchgeführt.

Heterotope, autologe Zelltherapie durch Knochenmarkzellen

Anhand zweier klinischer Studien konnte die Effektivität einer heterotopen, autologen Zelltherapie demonstriert werden.

Zum einen handelte es sich um Patienten mit aneurysmatischen Knochenzysten, deren Rezidivrate auch bei operativer Therapie in der Literatur mit ca. 20 bis 40 Prozent innerhalb von zwei Jahren angegeben wird.¹⁸ Zum anderen wurden Patienten mit Wirbelsäulendeformitäten im Rahmen einer dorsalen Spondylodese therapiert.

Durch eine intraoperative Vakuum-Jamshidi-Punktion des dorsalen Beckenkamms wurde ein Zellaspirat gewonnen, das einem Biomaterial (TCP, demineralisierte Knochenmatrix) zugesetzt wurde. Dieses Biomaterial-Zellkomposit wurde anschließend in die knöcherne Defektzone (Knochenzyste) eingebracht oder entsprechend im Falle der Wirbelsäulenkorrekturoperation dorsal angelagert (Abb. 5). Die Auswertung erfolgte anhand klinischer und radiomorphologischer Parameter. Von zwölf Patienten mit aneurysmatischen Knochenzysten (Durchschnittsalter: 10,25 Jahre, Standardabweichung: 3,9), die mit einer autologen Knochenmarkzelltherapie therapiert wurden, lag die Rezidivrate bei einem Follow-Up von durchschnittlich 20,5 Monaten (Standardabweichung: 5,6) bei 25,0 Prozent. Alle Rezidive fanden sich bei der Verwendung von demineralisierter Knochenmatrix (Grafton ), während sich bei Patienten, die Tricalciumphosphat als Zellcarrier erhielten, bisher keine Rezidive gezeigt haben.

Die Abbildung 6 zeigt beispielhaft den radiologischen Verlauf eines 13 Jahre alten Patienten mit einer aneurysmatischen Knochenzyste des proximalen Humerus vor und nach einer Knochenmarktransplantation. Im Falle der Spondylodesen hat sich im Nachuntersuchungszeitraum von zwei Jahren bisher keine Pseudarthrose gezeigt.

Grenzen, Möglichkeiten und Perspektiven einer zukünftigen Stammzelltherapie bei knöchernen Substanzdefekten

Obwohl die aktuellen Ergebnisse wissenschaftlicher Untersuchungen Grund zur Hoffnung für eine zukünftige Stammzelltherapie am Bewegungsapparat geben, kann eine heterologe Zelltransplantation derzeit nur nach HLA-Identität (Human Leucocyte Antigene) im Rahmen von klinischen Studien empfohlen werden. Insbesondere die derzeit bestehenden Fragen zur Immunogenität und Abstoßung sowie die biologische Sicherheit gegenüber einer neoplastischen Entdifferenzierung der transplantierten Zellen und die Gefahr viraler Infektionen verhindern derzeit noch eine breite Anwendung von Stammzelltherapeutika. Obwohl die osteogenetische Potenz von Stammzellen aus dem Knochenmark und aus Nabelschnurblut sowie aus dem embryonalen Gewebe in zahlreichen Arbeiten beschrieben wurde, sind die komplexen molekularen Mechanismen der zellulären Differenzierung in weiten Bereichen noch unbekannt und Gegenstand der aktuellen Forschung. Neben dem Ursprungsgewebe und den Spendereigenschaften beeinflussen lokale Signalproteine, zelluläre Adhärenzmechanismen, die lokale Zelldichte und die Kultivierungsbedingungen die weiteren Differenzierungsprozesse in vitro und in vivo.

Danksagung: Die Autoren bedanken sich bei folgenden Personen, die sie bei der Entwicklung und Durchführung des orthopädischen Stammzellprojekts unterstützt und zu dessen Gelingen beigetragen haben.

Frau Dr. med. vet. Annemarie Treiber – Leiterin der Tierversuchsanlage der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Frau Sabine Lensing-Höhn – Leitende Medizinisch-Technische Assistentin, Orthopädisches Forschungslabor, Orthopädische Universitätsklinik am UKD

Frau PD Dr. rer. nat. Gesine Kögler – Institut für Zelltherapie und Transplantationsdiagnostik/Nabelschnurblutbank am UKD

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Peter Wernet – Direktor des Instituts für Zelltherapie und Transplantationsdiagnostik am UKD

Herrn Dr. med. vet. Martin Sager – stellvertretender Leiter der Tierversuchsanlage der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Herrn Dr. rer. nat. Andreas Knipper – Kourion Therapeutics AG/ehem. Institut für Zelltherapie und Transplantationsdiagnostik

Herrn Özer Digestirici – Kourion Therapeutics AG/ehem. Institut für Zelltherapie und Transplantationsdiagnostik

Frau Iris Schrey – Tierversuchsanlage der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

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